現(xiàn)階段PCR運(yùn)用已取得長(zhǎng)久的發(fā)展壯大，已變成疫病診斷，疫情控制等層面的有力工具，為了能規(guī)避在PCR方法中發(fā)生污染及發(fā)生假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果等狀況，確保結(jié)果的精確性，在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境安全控制上嚴(yán)苛保證實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立區(qū)域設(shè)計(jì)，功能分區(qū)明確，確保實(shí)驗(yàn)室潔凈環(huán)境，人流物流嚴(yán)苛分流，設(shè)計(jì)合理的壓力梯度，建立有序的氣流組織方向，切實(shí)保證規(guī)避交叉污染。

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)首先考慮――規(guī)避污染

因?yàn)?span>PCR技術(shù)的高度敏感性，PCR技術(shù)要求高、影響因素多，從樣品制備到結(jié)果的形成，任何一處細(xì)微的差錯(cuò)均會(huì)造成結(jié)果的偏差，造成樣品的假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。

PCR實(shí)驗(yàn)室研究過程中，許多操作都會(huì)形成氣溶膠，例如離心、混勻等操作。為確保環(huán)境安全，PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)建設(shè)需獨(dú)立區(qū)域設(shè)計(jì)，規(guī)避與其余環(huán)境的交叉混雜，以下兢美按照我們做過的工程案例從平面布局、凈化區(qū)域劃分，人物流設(shè)計(jì)和壓差控制等層面具體化講解。

一、PCR實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范

《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB19489-2008

《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]8號(hào)文

《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)文

《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)》衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號(hào)文附件

《基因檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求》國(guó)家質(zhì)監(jiān)檢驗(yàn)總局SN/T1193-2003

《潔凈室及相關(guān)受控環(huán)境-生物污染控制》國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO14698

《潔凈廠房設(shè)計(jì)規(guī)范》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB500732013

《潔凈室施工及驗(yàn)收規(guī)范》GB50591-2010

《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18832002

《生物安全實(shí)驗(yàn)室建筑技術(shù)規(guī)范》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB50346-2011《病原微生物實(shí)驗(yàn)室生物安全管理?xiàng)l例》衛(wèi)生部(2004-11-12)

二、PCR實(shí)驗(yàn)室區(qū)域劃分

1、試劑準(zhǔn)備區(qū)：用以試驗(yàn)試劑的準(zhǔn)備。

該區(qū)域?yàn)?strong>正壓，作用是避免污染物質(zhì)溢入。該區(qū)域里面又可分成3個(gè)區(qū)域：普通提取試劑的準(zhǔn)備區(qū)、PCR試劑準(zhǔn)備區(qū)和PCR主反應(yīng)液準(zhǔn)備區(qū)。在普通提取試劑的準(zhǔn)備區(qū)內(nèi)準(zhǔn)備一些樣品核酸提取時(shí)所需的裂解液、提取液等；PCR試劑準(zhǔn)備區(qū)用以PCR試劑的制備和保存。例如準(zhǔn)備引物、探針等PCR試劑。為了能避免交叉污染，避免反復(fù)冷凍和解凍，試劑存貯溶液應(yīng)當(dāng)被平均為小的工作體積，存儲(chǔ)在這個(gè)房間內(nèi)以便后用：PCR主反應(yīng)液準(zhǔn)備區(qū)將實(shí)行主反應(yīng)混合液(除了樣品。所有的PCR所需試劑的混合)添加到PCR管的操作。重要提示：不可以將其他房間內(nèi)的材料(包含擴(kuò)增、模板和目標(biāo)核酸或陽(yáng)性對(duì)照、供應(yīng)品、或設(shè)備)帶進(jìn)試劑準(zhǔn)備區(qū)。

2、樣品準(zhǔn)備區(qū)：該區(qū)域無壓力設(shè)定要求。

該區(qū)域是用以對(duì)樣品實(shí)行分樣，將樣品實(shí)行研磨、粉碎、勻漿的區(qū)域。考慮到在這些粉碎、研磨和勻漿處理過程中會(huì)產(chǎn)生氣溶膠，因而，存在陽(yáng)性樣品污染后續(xù)操作的可能性。該區(qū)域與后邊的區(qū)域應(yīng)嚴(yán)苛隔離，應(yīng)放到與后邊的3個(gè)區(qū)域隔開的獨(dú)立的房間內(nèi)中。在樣品準(zhǔn)備區(qū)內(nèi)還可開設(shè)1個(gè)專門的封閉區(qū)或房間內(nèi)用以樣品的接收和存儲(chǔ)。這一房間內(nèi)能夠擺放冰箱用以樣品存儲(chǔ)，應(yīng)當(dāng)和樣品準(zhǔn)備區(qū)其他區(qū)域隔離開。樣品準(zhǔn)備區(qū)域的工作人員不能進(jìn)到試劑準(zhǔn)備區(qū)。

3、核酸提取區(qū)：核酸提取區(qū)是實(shí)行樣品核酸提取的區(qū)域。

該區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，作用是避免核酸外溢導(dǎo)致污染。樣品準(zhǔn)備區(qū)又包含從樣品中實(shí)行核酸提取和純化的區(qū)域及其將核酸加到包含PCR主反應(yīng)混合液管中的操作區(qū)域。添加完樣品后，PCR管的蓋子要盡量快地蓋好。使用PCR板和膠蓋時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照和含目標(biāo)序列的樣品要與待測(cè)樣本分開操作，以避免模板添加時(shí)導(dǎo)致交叉污染

重要提示：這一房間內(nèi)里的一切物品不能帶人試劑準(zhǔn)備區(qū)。

4、擴(kuò)增和產(chǎn)品檢測(cè)區(qū)：該區(qū)域是用來實(shí)行PCR擴(kuò)增和PCR分析。

PCR儀擺放在這個(gè)區(qū)域。房間內(nèi)保持負(fù)壓，作用是避免核酸外溢。在該區(qū)域工作人員一定要始終穿戴工作服和手套，在離開房間內(nèi)前脫掉，避免擴(kuò)增子污染其他地點(diǎn)。所有的用以擴(kuò)增和產(chǎn)品檢測(cè)的設(shè)備要特定用以這一房間內(nèi)。PCR分析]二作也設(shè)定在該區(qū)域，例如：酶切、測(cè)序、克隆等，但實(shí)驗(yàn)室應(yīng)盡量把這些活動(dòng)分隔在不同區(qū)域或不同房間內(nèi)。以降低擴(kuò)增產(chǎn)物的污染風(fēng)險(xiǎn)。要是沒有條件在該區(qū)域開設(shè)負(fù)壓，此區(qū)域必須建立排風(fēng)裝置。

三、PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要點(diǎn)

1、分散方式PCR實(shí)驗(yàn)室

所謂的分散方式PCR實(shí)驗(yàn)室，就是指完成以上所述實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房彼此之間距離較遠(yuǎn)，呈分散布置方式。針對(duì)這種布置方式的PCR實(shí)驗(yàn)室，考慮到每個(gè)實(shí)驗(yàn)相互間不容易相互干擾，因而無須特殊條件要求。

2、組合方式PCR實(shí)驗(yàn)室

所謂的組合方式PCR實(shí)驗(yàn)室,就是指完成PCR四個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房相鄰布置，組成獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)域的方式。針對(duì)組合方式PCR實(shí)驗(yàn)室，考慮到每個(gè)實(shí)驗(yàn)間集中布置，很容易導(dǎo)致相互干擾，因而，對(duì)總體布局及其屏障系統(tǒng)具有相應(yīng)的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以降低室內(nèi)外空氣交換。

四、PCR實(shí)驗(yàn)室氣流設(shè)計(jì)方案

人流物流設(shè)計(jì)方案各行其道，避免交叉混雜，整體區(qū)域設(shè)計(jì)方案1個(gè)公用走廊，工作區(qū)域相互間設(shè)計(jì)方案試劑物品傳輸專門窗，保證人物分流。

1、物流：在試劑準(zhǔn)備區(qū)與標(biāo)本制備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)與PCR擴(kuò)增區(qū)相互間，及其擴(kuò)增區(qū)域和純化區(qū)相互間設(shè)計(jì)方案有電子連鎖不銹鋼傳遞窗，以單向?qū)嵭性噭?biāo)本等物品傳送，配制的試劑通過單向傳遞窗由試劑準(zhǔn)備區(qū)傳輸?shù)綐?biāo)本制備區(qū)，處理過的標(biāo)本通過單向傳遞窗由標(biāo)本制備區(qū)傳輸?shù)?span>PCR擴(kuò)增區(qū)，按照工藝流程逐次傳輸，避免返流。單向物品傳送系統(tǒng)既確保了標(biāo)本試劑不受污染，又確保了標(biāo)本試劑不污染環(huán)境。

2、人流：工作人員通過閘間分別進(jìn)到各自實(shí)驗(yàn)區(qū)域，出入各實(shí)驗(yàn)區(qū)域需要在閘間區(qū)域更換潔凈服，洗手消毒等。

五、PCR實(shí)驗(yàn)室壓差設(shè)計(jì)

PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)設(shè)計(jì)為負(fù)壓潔凈室，通過壓差操控，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)全過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)室與非潔凈區(qū)之間的閘間保持正壓，＞10Pa，實(shí)驗(yàn)與閘間之間的氣流組織方向?yàn)椋涸噭?zhǔn)備區(qū)空氣流向閘間，標(biāo)本制備區(qū)流向閘間，而PCR擴(kuò)增區(qū)氣流方向由閘間流向PCR擴(kuò)增區(qū)，純化區(qū)同理；

同時(shí)按照試劑單向流方向，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間設(shè)計(jì)不同壓力梯度來實(shí)現(xiàn)單向氣流組織方向，由試劑準(zhǔn)備區(qū)（+20Pa）、標(biāo)本制備區(qū)（+15Pa）、擴(kuò)增反應(yīng)一區(qū)（-5Pa）、純化區(qū)（-10Pa）、擴(kuò)增反應(yīng)二區(qū)（-20Pa）、到后純化區(qū)（-25Pa）壓力逐漸降低，形成單向負(fù)壓壓力梯度。

六、PCR實(shí)驗(yàn)室污染的預(yù)防與操控

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的關(guān)鍵難題是怎樣避免污染。在現(xiàn)實(shí)工作中，普遍的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。因?yàn)橐坏┌l(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須要停止，直至找出污染源才行，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須要作廢，需再次采取實(shí)驗(yàn)。因而發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不但耗時(shí)并且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因而要避免污染，首要應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

1、運(yùn)行區(qū)域的嚴(yán)格劃分

（1）每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)置合理；

（2）每個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有顯著的標(biāo)記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免每個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

2、合理的系統(tǒng)設(shè)置

（1）合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng)；

（2）嚴(yán)格的氣流壓力操控，確保不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

3、規(guī)范的實(shí)際操作

（1）擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須要采取上崗培訓(xùn)，經(jīng)培訓(xùn)合格后才能從事臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的運(yùn)行；

（2）在實(shí)驗(yàn)操作全過程中，操作者必須要戴手套，并時(shí)常更換。除此之外，實(shí)際操作中使用一次性帽子也是一個(gè)有效地防止污染的措施；

（3）清潔運(yùn)行及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)運(yùn)行結(jié)束后，必須要立即對(duì)本區(qū)采取清潔。除常規(guī)的消毒液體對(duì)表面采取擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對(duì)某些實(shí)驗(yàn)設(shè)備還應(yīng)采取高壓消毒處理。

4、嚴(yán)格的管理

（1）嚴(yán)格控制出入實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)不相關(guān)的人員不能隨意出入實(shí)驗(yàn)室，有條件的情形下要設(shè)置獨(dú)立的通道和出入整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)的門；

（2）盡可能減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的行走以減少交叉污染的可能性。

（3）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不可以在實(shí)驗(yàn)室中亂倒，必須要經(jīng)消毒液浸沒消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，使用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸沒消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒處理等；

（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)有可能會(huì)用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)尤其留意實(shí)驗(yàn)人員的安全保障。

5、完善的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施

完善的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是確保實(shí)驗(yàn)運(yùn)行的必備條件，應(yīng)依據(jù)每個(gè)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配置相對(duì)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、加樣器等。